Генни технологии — урок по биология

1. Ножиците: рестриктази

Генните технологии са набор от методи, с които ДНК се изрязва, копира, пренася в друг организъм, разчита и променя. Как е устроена ДНК и как по нея се прави , е обяснено в урока ДНК, гени и синтез на белтък. Тук ще видим инструментите – повечето от тях са взети от .

О

Рестриктаза (рестрикционна ендонуклеаза)

Бактериален ензим, който разпознава кратка последователност в двойната верига на ДНК (обикновено 4–8 bp, базови двойки) и я срязва на определено място. Бактериите ги използват, за да режат ДНК на нападащите ги вируси; собствената им ДНК е защитена с метилиране.

Местата за рязане обикновено са палиндроми: двете вериги, прочетени в посока 5′ → 3′, имат еднаква последователност. Мястото на EcoRI (от бактерията E. coli) е 5′-Г↓ААТТЦ-3′, а на другата верига – също 5′-Г↓ААТТЦ-3′. Разрезите са разместени и остават къси едноверижни опашки ААТТ – лепливи краища. Те могат да се свържат с с всеки друг край, срязан със същия (). Някои ензими (например SmaI, ЦЦЦ↓ГГГ) режат точно по средата и оставят тъпи краища.

Т

Колко често се среща едно място

Ако четирите нуклеотида се срещат с еднаква честота и случайно, място от

n

bp се среща средно веднъж на

4^n

bp: за 4 bp – на 256, за 6 bp – на 4096, за 8 bp – на 65 536 bp. Линейна молекула с

k

разреза дава

k + 1

фрагмента, а кръгова (плазмид) –

k

фрагмента.

Пример

Линейна ДНК с дължина 10 000 bp има места за EcoRI на 3000 и 8000 bp и място за HindIII на 6500 bp. Какви фрагменти дава всеки ензим поотделно и двата заедно?

EcoRI – два разреза, три фрагмента: $3000$ , $5000$ и $2000$ bp.
HindIII – един разрез: $6500$ и $3500$ bp.
Двата заедно – разрезите са на 3000, 6500 и 8000: фрагменти $3000$ , $3500$ , $1500$ и $2000$ bp.
Проверка: във всеки случай сборът е 10 000 bp.

2. Гел-електрофореза: подреждане по размер

Как разбираме какви фрагменти са се получили? Пробите се слагат в ямки в желе от агароза ( от морски ) и през гела се пуска . Фосфатните групи правят ДНК отрицателно заредена и тя пътува към (+). Агарозата е мрежа от пори: малките фрагменти се провират лесно и стигат далеч, а големите изостават. След оцветяване всеки вид фрагменти се вижда като отделна ивица.

О

Гел-електрофореза

Разделяне на молекули ДНК (или белтъци) по размер с електрично поле в гел. В една писта се пуска маркер – смес от фрагменти с известни размери. Пробегът е приблизително линейна функция на логаритъма на размера:

d \approx a - b \lg(\text{размер})

, затова размерът на непознатата ивица се отчита по маркера.

Пусни тока, натисни ивица и прочети размера ѝ по маркера. Опитай се от трите писти да начертаеш картата – къде режат EcoRI и HindIII – и чак тогава я покажи.

t, min0

Пусни тока и изчакай ивиците да се разделят.

Линейна молекула: k разреза дават k + 1 фрагмента. Сумата на фрагментите във всяка писта е 10 000 bp.

💡 ДНК е заредена отрицателно и пътува към анода (+). По-малките фрагменти се провират по-лесно през порите на агарозата и стигат по-далеч. Пробегът е приблизително линейна функция на логаритъма на размера – затова размерът се отчита по маркера в логаритмичен мащаб. Маркерът: 10 000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000 и 500 bp.

Логаритмичната връзка има важно следствие: ивиците на 1000 и 2000 bp са толкова далеч една от друга, колкото ивиците на 2000 и 4000 bp. Затова при разчитането между две ивици на маркера не се взема на размерите.

3. Рекомбинантна ДНК: ген в бактерия

През 1973 г. Стенли Коен и Хърбърт Бойер вмъкват чужд в бактериален и показват, че бактерията го копира при всяко делене. Така се ражда генното инженерство. Плазмидът служи за вектор – „превозното средство“, което пренася гена в клетката.

О

Рекомбинантна ДНК

Молекула ДНК, съставена от парчета с различен произход – например бактериален плазмид с вмъкнат човешки ген. Получава се като плазмидът и генът се срежат с една и съща рестриктаза (лепливите краища си пасват) и се зашият с ДНК лигаза.

Следва трансформация: бактериите се обработват (например с калциев хлорид и кратко затопляне), за да поемат плазмида. Това успява при малка част от клетките – трябва да ги отличим. Плазмидът носи ген за устойчивост на и бактериите се посяват върху среда с ампицилин: оцеляват само тези с плазмид. Но плазмидът може да се затвори и сам, без гена. Тогава помага синьо-белият тест.

💡 Плазмидът носи ген за устойчивост на ампицилин и гена lacZ за ензима β-галактозидаза. Местата за рязане са вътре в lacZ. Ако генът се вмъкне там, lacZ се „разваля“ и колонията остава бяла; ако плазмидът се затвори без гена, ензимът разгражда X-gal до синьо багрило. Числата са примерни – показват отношението между случаите.

Първото лекарство, произведено така, е човешкият инсулин – одобрен през 1982 г. Дотогава диабетиците използвали от на свине и говеда, който се различава с една до три и при някои хора предизвиква . Днес по същия начин в бактерии, или клетъчни култури се правят , фактори на , и . Бактериите обаче не могат да изрежат , затова в тях се вмъква копие на гена без интрони – получено от с ензима обратна транскриптаза.

4. PCR: милиард копия за час

О

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Многократно копиране на избран участък от ДНК в епруветка. Нужни са: ДНК матрица, два праймера (къси едноверижни ДНК, комплементарни на краищата на участъка), четирите нуклеотида и топлоустойчива ДНК полимераза. Всеки цикъл има три стъпки: денатурация (около 95 °C – веригите се разделят), свързване на праймерите (около 50–65 °C) и удължаване (72 °C).

Полимеразата на човека би се при първото нагряване. Решението идва от бактерията Thermus aquaticus, открита през 1969 г. в горещите извори на Йелоустоун. Нейната Taq полимераза издържа десетки цикли до 95 °C и работи най-добре около 72 °C. Тъй като всеки цикъл удвоява броя на молекулите, растежът е .

Т

Брой копия

След

n

цикъла:

N = N_0 \cdot 2^n

при пълно удвояване и

N = N_0 (1 + E)^n

при ефективност

E

. Не всички копия са с точната дължина: от една начална молекула след

n

цикъла участъците точно от праймер до праймер са

2^n - 2n

– в първите два цикъла няма нито един, а след 30 цикъла те са почти всичко.

E1цикъл0

цикли0копия1Ct33,2време0 min

На всяка начална молекула: 2⁰ = 1 двойни вериги; с точната дължина (от праймер до праймер): 2⁰ − 2·0 = 1

Кривата пресича прага при цикъл 33,2. Повече ДНК в началото → по-ранен Ct: 100 пъти повече молекули дават Ct с около 6,6 цикъла по-малко (2 на степен 6,6 ≈ 100).

💡 Един цикъл: 30 s при 95 °C (веригите се разделят), 30 s при 55 °C (праймерите се свързват), 60 s при 72 °C (Taq полимеразата удължава). Моделът е опростен: всеки цикъл добавя E·N·(1 − N/Nmax) копия. При qPCR апаратът мери флуоресценцията след всеки цикъл и отчита Ct – колкото по-рано, толкова повече ДНК е имало в пробата.

Към 25–30-ия цикъл праймерите и намаляват и кривата излиза на плато. При количествената PCR (qPCR, в реално време) багрило свети, когато се свърже с двойната верига, и апаратът мери светенето след всеки цикъл. Цикълът, при който сигналът мине прага (Ct), казва колко ДНК е имало в началото: всеки цикъл по-рано означава два пъти повече. Така работят PCR тестовете за вируси – за РНК вирусите преди това РНК се превръща в ДНК с обратна транскриптаза.

Пример

Две проби имат Ct = 20 и Ct = 26. Колко пъти повече ДНК е имало в първата при 100 % ефективност? А при 90 %?

$\Delta C_t = 6$
При удвояване: $2^6 = 64$ пъти.
При $E = 0{,}9$ всеки цикъл умножава по $1{,}9$ : $1{,}9^6 \approx 47$ пъти.

5. Разчитане на ДНК: секвениране

През 1977 г. Фредерик Сангър измисля как да се прочете последователността на ДНК. Копирането става в присъствие на малко дидезоксинуклеотиди – нуклеотиди без OH група на 3′ въглерода. Когато полимеразата вгради такъв, веригата не може да продължи. Получава се смес от вериги с всички възможни дължини, всяка завършваща на известна база. Подредени по размер (с електрофореза в тънка капиляра), те дават последователността буква по буква. При съвременния вариант четирите вида краища светят в различни цветове.

О

Секвениране

Определяне на реда на нуклеотидите в ДНК. Методът на Сангър (с дидезоксинуклеотиди) чете по около 800–1000 bp наведнъж. Съвременните методи („следващо поколение“) четат милиони къси или дълги фрагменти едновременно, а компютър ги сглобява по припокриванията.

Проектът „Човешки геном“ (1990–2003) струва около 3 милиарда долара и прочита почти целия геном – около 3,1 милиарда bp, в които има около 20 000 гена за белтъци. Днес геномът на един човек може да се прочете за ден-два и цена от на стотици долари. Последните „дупки“ в последователността са запълнени едва през 2022 г.

6. ДНК профил

Около 99,9 % от ДНК на всеки двама души е една и съща. Разликите са най-големи в STR (кратки тандемни повтори): участъци, в които къса последователност, например ГАТА, се повтаря различен брой пъти. Всеки човек има по два на всеки локус – един от майката и един от бащата, и всеки алел е с определен брой повтори.

О

ДНК профил

Наборът от дължини на STR алелите в стандартни локуси (в Европа и САЩ – около 20). Участъците се умножават с PCR и размерите им се мерят с електрофореза. Ако локусите се унаследяват независимо, честотата на целия профил е произведението от честотите на генотипите на отделните локуси.

Пример

На един локус майката има алели с 8 и 11 повтора, а детето – с 8 и 14. Кой от двамата мъже може да е бащата: А (11, 12) или Б (9, 14)?

Детето получава по един алел от всеки родител. Алелът 8 може да е от майката.
Тогава 14 трябва да е от бащата.
Мъж А няма алел 14 – изключен е (на този локус). Мъж Б го има – може да е бащата.
Изключването е сигурно, а съвпадението – само вероятно; затова се гледат много локуси.

Методът е създаден през 1984 г. от Алек Джефрис в Англия. Още през 1986–1988 г. с него е хванат убиец и е оправдан заподозрян, който вече бил признал. ДНК профилите помагат и при установяване на бащинство, при разпознаване на жертви на бедствия и в изследванията на .

7. ГМО, CRISPR, генна терапия и клониране

О

Генетично модифициран организъм (ГМО)

Организъм, в чиято ДНК е вмъкнат или променен ген с методите на генното инженерство. Организъм, който носи ген от друг вид, се нарича трансгенен.

Bt царевицата носи ген от почвената бактерия Bacillus thuringiensis за белтък, отровен за на някои насекоми, но не и за бозайниците. Златният ориз прави бета-каротин – от него организмът получава А, чийто недостиг причинява слепота при деца в бедните страни. Привържениците изтъкват по-високите добиви и по-малкото пръскане. Противниците се притесняват от кръстосване с дивите видове, от устойчиви вредители и от зависимостта на фермерите от няколко големи компании. Научните организации като цяло смятат одобрените ГМ храни за толкова безопасни, колкото и обикновените, но дебатът продължава. В ЕС всяко ГМО минава през отделно разрешение, а храните с ГМ съставки трябва да са етикетирани; редица страни – сред тях и България – забраняват отглеждането на ГМ култури на своя територия.

О

CRISPR-Cas9

Система за точно редактиране на гени, взета от бактериите (там тя защитава от вируси). Ензимът Cas9 се насочва от водеща РНК от около 20 нуклеотида, комплементарна на целта, и срязва двете вериги на ДНК точно там. Клетката поправя разреза – като често разваля гена или вмъква подадена ѝ нова последователност.

Еманюел Шарпантие и Дженифър Дудна публикуват метода през 2012 г. и получават за него Нобеловата награда по химия за 2020 г. В края на 2023 г. е одобрено първото лечение с CRISPR – на сърповидноклетъчна анемия и бета-таласемия: стволови клетки от костния мозък на болния се редактират извън тялото и се връщат обратно.

О

Генна терапия

Лечение, при което в клетките на болния се внася работещо копие на ген или се поправя повреден ген. Най-често генът се пренася с обезвреден вирус (вирусен вектор). Промени в телесните клетки не се предават на потомството; промени в зародишните клетки или в ембриона – се предават.

Клонирането е получаване на генетично еднакви копия – на ген, на клетка или на цял организъм. Овцата Доли, родена през 1996 г. в Шотландия, е първият бозайник, клониран от клетка на възрастно животно: ядрото на клетка от млечната жлеза е пренесено в , от която е отстранено собственото ѝ ядро. Това показва, че ядрото на диференцираната клетка още съдържа всички гени. Стволовите клетки не са диференцирани и могат да дадат различни видове клетки. През 2006 г. Шиня Яманака показва, че обикновени клетки от кожата могат да се „върнат“ в стволови само с четири гена.

Тези възможности поставят етични въпроси: кой има право да знае генома ни, бива ли да се променя ДНК на , кой ще има достъп до скъпите лечения. През 2018 г. китайски учен обявява раждането на две момичета с редактирани ембриони. Действията му са осъдени почти единодушно от научната общност и той е осъден на затвор – и до днес редактирането на човешки ембриони за бременност е забранено или силно ограничено в повечето страни.

8. Тренажор

Копия при PCR, честота на местата за рязане, фрагменти, прагов цикъл Ct.

✅ Решени: 0🔥 Серия: 0🏆 Рекорд: 0

n = 7

Колко двойни вериги с точната дължина (от праймер до праймер) има след 7 цикъла PCR, започнати от една молекула?

9. Генните технологии в числа

0 / 6

🔍 Един косъм на местопрестъплението

В корена на косъм има ДНК от около 10 клетки, т.е. 10 копия на изследвания участък. Колко копия ще има след 30 цикъла PCR при пълно удвояване? Отговори в милиарди.

⏱️ Колко трае една PCR

Програмата започва с 2 min при 95 °C, след което 30 пъти повтаря: 30 s при 95 °C, 30 s при 55 °C и 60 s при 72 °C. Колко минути трае, без времето за загряване и охлаждане?

✂️ Колко пъти ще среже EcoRI

EcoRI разпознава 6 bp. Геномът на човека е около 3,2 милиарда bp. Около колко хиляди места за EcoRI очакваш, ако последователността беше случайна?

🧫 Синьо или бяло

След клониране на петрито с ампицилин и X-gal са пораснали 300 колонии, от които 60 са сини. Какъв процент от колониите вероятно носят вмъкнатия ген?

📏 Разчитане на гел

На гела ивицата от 1000 bp на маркера е изминала 30 mm, а ивицата от 100 bp – 60 mm. Пробегът е линейна функция на логаритъма на размера. Колко bp е фрагмент, изминал 45 mm?

🧬 Колко рядък е един ДНК профил

В три независими STR локуса генотипът на заподозрения се среща с честоти 0,1, 0,05 и 0,2 в населението. Средно у колко души ще се срещне същият профил на трите локуса?

Зелено – решена сам(а), жълто – с решението. Десетичните числа може да пишеш със запетая.

10. ⚠️ Чести грешки

Посоката в гела

✗ Големите фрагменти минават по-далеч, защото са по-тежки.

✓ Обратното: малките се провират по-лесно през порите на гела и минават по-далеч.

Отчитане по маркера

✗ Между ивиците на 1000 и 2000 bp, точно по средата, е фрагмент от 1500 bp.

✓ Пробегът зависи линейно от логаритъма на размера. По средата е $\displaystyle \sqrt{1000 \cdot 2000} \approx 1414$ bp.

Брой фрагменти

✗ Два разреза винаги дават три фрагмента.

✓ Само при линейна ДНК. Кръговият плазмид с два разреза дава два фрагмента.

PCR

✗ При PCR се копира цялата ДНК на пробата.

✓ Копира се само участъкът между двата праймера.

Ампицилинът

✗ Колониите върху ампицилин носят вмъкнатия ген.

✓ Те носят плазмида – със или без гена. Кои имат гена, показва синьо-белият тест.

ГМО

✗ Само ГМ храните съдържат гени.

✓ Всяка храна от растение или животно съдържа ДНК и гени. Изяждаме ги и ги разграждаме както всичко останало.

11. 🎯 Бърз тест

1 / 9

✓ 0

Какво прави рестриктазата?

Избери отговор (или натисни 1–4)

12. 📝 Задачи за упражнение

0 / 0

Ниво А· Областен кръг

Ниво В· Национален кръг

Ниво С· Международна олимпиада

13. Обобщение

✓ Рестриктазите режат ДНК на палиндромни места; лепливите краища се свързват с всеки край, срязан със същия ензим
✓ Място от $n$ bp се среща средно на $4^n$ bp; линейна ДНК с $k$ разреза – $k + 1$ фрагмента, плазмид – $k$
✓ Гел-електрофореза: ДНК пътува към анода, малките фрагменти – по-далеч; размерът се отчита по маркера в логаритмичен мащаб
✓ Рекомбинантна ДНК: рязане с една рестриктаза, зашиване с , трансформация, подбор с антибиотик и синьо-бял тест
✓ PCR: денатурация, праймери, удължаване с Taq полимераза; $N = N_0 \cdot 2^n$ ; при qPCR по-ранен Ct означава повече ДНК
✓ Секвениране по Сангър с дидезоксинуклеотиди; ДНК профил по дължините на STR алелите
✓ ГМО, CRISPR-Cas9, генна терапия, клониране и стволови клетки – големи възможности и етични въпроси

💡 Интересен факт

Овцата Доли е кръстена на кънтри певицата Доли Партън – защото е клонирана от клетка на млечната жлеза. А най-полезният ензим в генните технологии идва от гореща локва в Йелоустоун: без бактерията Thermus aquaticus, открита при търсене на живот в горещи извори, PCR щеше да изисква нова порция ензим след всеки цикъл.